Amplicon：基因分析中的重要工具

一、amplicon 的定義和基本概念

Amplicon 是 DNA 序列上的特定片段，通常是引物擴增反應得到的 DNA 片段。由於擴增反應中使用一對引物，因此得到的 amplicon 是雙鏈 DNA 片段。通過分析 amplicon 的序列，可以研究樣本 DNA 中的特定基因區域、基因型、變異信息等，被廣泛應用於遺傳學研究、醫學檢測、環境分析等領域。

二、amplicon 在基因分析中的應用

1.遺傳多樣性研究

Amplicon 可以用於分析種群或個體之間基因序列的差異，研究它們的遺傳多樣性。例如，通過擴增線粒體 DNA 上的一段序列，可以比較不同種系或地理群體的遺傳關係；通過擴增全基因組中的一些可變位點，可以獲得個體之間的遺傳分型，如數據分析軟體 DNAsp 和 Arlequin 等工具可以計算多樣性指標（如π值、核苷酸多態性等），反映遺傳多樣性程度和特徵。

2.醫學診斷及疾病研究

Amplicon 技術也被廣泛應用於醫學領域，如基因遺傳病的檢測、腫瘤相關的基因突變分析等。通過特定引物擴增某些疾病相關基因片段，然後對擴增產物進行二代測序，可獲取單核苷酸變異、缺失、插入或重排等變異信息，輔助醫生做出診斷和治療方案，也有助於分析某些病理生理過程的基因機制。

3.環境監測與物種鑒定

Amplicon 技術還可以用於評估環境中的物種多樣性。在海洋、土壤等環境中，直接提取 DNA 並擴增一些特定區域的片段，就可以檢測出其中包括的多個物種。例如，擴增細菌 16S rRNA 基因，可以鑒定細菌種類和丰度；擴增植物葉綠體 trnL 和 ITS 片段，可以研究植物多樣性及其分布情況。同時，通過比較不同生態系統中的物種組成和丰度分布，可以了解全球生物多樣性的分布和變化。

三、amplicon 數據分析的基本步驟

Amplicon 數據分析包括質控、序列處理和注釋、多序列比對、進化分析和生態統計等多個方面。下面是數據分析的大體步驟。

1.質控

對擴增產物的質量進行評估，剔除低質量序列數據，去除引物、接頭等非生物信息，減少雜訊和誤差。常用的質控工具有 Trimmomatic、FastQC 等。

2.序列處理和注釋

對 amplicon 序列進行去除冗餘、合併、去冗餘以及對替換和插入缺失的序列思路進行處理。主要目的在於獲得每個樣本的高質量序列，並將其注釋為特定物種基因或特定區域的基因。

3.多序列比對

將多個樣品的序列進行比對，找到它們之間的同源區域，進而確定它們之間的異構差異，可採用程序MUSCLE進行比對。

4.進化分析

通過構建進化樹、計算進化方向、檢測選擇壓力等方法，研究基因型演化的模式和過程，揭示它們之間的進化關係和演化動態。

5.生態統計

對 amplicon 數據進行多樣性分析、群落結構分析，比較不同生態系統之間的差異，解析與環境因素的關係。

四、amplicon 數據分析的示例代碼

#此處給出 amplicon 數據的多序列比對代碼示例

from Bio import AlignIO
from Bio.Align import MultipleSeqAlignment
from Bio.Seq import Seq
from Bio.SeqRecord import SeqRecord
from Bio.Alphabet import generic_dna

#讀取 FASTA 格式文件，生成序列比對對象
alignments = AlignIO.read('amplicon_seqs.fasta', 'fasta')

#打開輸出文件
output_file = open('amplicon_alignment.fasta', 'w')

#獲取序列比對長度
alignment_length = alignments.get_alignment_length()

#將相同引物擴增產生的 amplicon 進行合併
amplicon_seqs = {}
for record in alignments:
    seq_name = record.id.split('_')[0] #樣本名稱，如 sample1
    amplicon_name = record.id.split('_')[1] #amplicon 名稱，如 16S
    if amplicon_name not in amplicon_seqs:
        amplicon_seqs[amplicon_name] = {}
    if seq_name not in amplicon_seqs[amplicon_name]:
        amplicon_seqs[amplicon_name][seq_name] = SeqRecord(Seq('', generic_dna), id=seq_name)
        #添加未對齊的空序列
    amplicon_seqs[amplicon_name][seq_name].seq += record.seq

#合併 amplicon 序列對象，生成新的序列比對對象
new_records = []
for amplicon_name, recs in amplicon_seqs.items():
    merged_seqs = [v for k, v in sorted(recs.items())] #按樣本名稱升序排列
    #合併序列
    merged_seq = merged_seqs[0].seq
    for i in range(1, len(merged_seqs)):
        merged_seq += merged_seqs[i].seq
    #生成序列記錄對象
    merged_rec = SeqRecord(merged_seq, id=amplicon_name)
    new_records.append(merged_rec)
merged_alignment = MultipleSeqAlignment(new_records, alphabet=generic_dna)

#將序列比對對象輸出到文件
AlignIO.write(merged_alignment, output_file, 'fasta')

#關閉文件
output_file.close()