宏基因組測序和全基因組測序「一代測序和二代測序區別比較」

自然環境中，很大一部分微生物不可用實驗室傳統培養的方法獲得，成為了研究自然界微生物群落結構、生態功能及其相互關係的最大障礙。

隨著分子生物學技術在微生物生態學研究中的應用，微生物多樣性研究有了新的突破。起初，對於分子微生態學的研究大多是利用微生物16S核糖體RNA（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）基因特點及PCR 等分子生物學研究手段，包括變性/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）、16S rRNA基因單鏈構象多態性分析（SSCP）、末端限制片段長度多態性（T-RFLP）、實時定量PCR（Real-time quantitative PCR）等技術。

進入20世紀90年代末，隨著高通量測序技術的發展，基於基因組文庫的分析也為微生物多樣性結構和功能基因組的研究，提供了嶄新的思路。

16S rRNA

16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA），簡稱16S rRNA，是原核生物的核糖體中30S亞基的組成部分，編碼16s rRNA的基因被稱為16s rRNA基因（16s rDNA）。16S rRNA的長度約為1,542 nt，既含有高度保守區域，又有中度保守和高度變化的區域。保守區為基本所有的細菌所共有，且不同細菌間序列無差別，因而被稱為「細菌化石」；而保守區之間為可變區（V1～V10），不同種屬之間有不同程度差異，適用於進化距離不同的各類細菌親緣關係的研究。

我們可以在16S rRNA 基因的保守序列區間設計通用引物，擴增細菌的可變區片段來進行序列比對，並與真菌、病毒等其他微生物相區別。16S rRNA基因測序一般是利用測序平台對16S rRNA基因的V3-V4或V4-V5可變區進行測序，以此來研究微生物多樣性。

圖1. 16S rRNA基因結構示意圖

高通量測序技術原理及發展

高通量測序技術又稱「下一代」或「二代」測序技術（Next Generation Sequencing, NGS）。相對一代測序技術（Sanger Sequencing），NGS 一次並行對幾十萬至幾百萬條DNA分子進行測定及讀長較短等為標誌。

目前用於微生物群落多樣性研究中的高通量測序平台主要有羅氏公司的454法、Illumina公司的Solexa法和ABI公司的SOLiD法。二代測序僅能對16S rRNA基因的部分可變區測序，而隨後出現的三代測序突破讀長限制實現了16S rRNA基因的全長測序，進而能更全面、準確地解析微生物群落結構。

圖2 高通量測序平台的發展

目前，高通量測序是一個邊合成邊測序的過程，使用的是熒光可逆終止子。每個可逆終止子的鹼基3』端都有一個阻斷基團，而在側邊帶有一種熒光。由於有4種不同的鹼基（ATCG），因此也會有對應4種不同顏色的熒光。開始擴增每次結合上一個鹼基，DNA的擴增便會停止，此時能收到一種熒光信號。然後放試劑除去阻斷基團，進行下一個鹼基的結合，以此類推得到一連串的熒光信號組合序列。而根據熒光的顏色我們便可以確定每一個位點的基因型，即可以得到這一段DNA片段的序列。

圖3 高通量測序技術工作原理

二代測序平台一般只能對單個或連續的兩三個可變區序列進行測序分析，通常情況下無法獲得rRNA基因全長序列的信息，因而往往難以在屬、種甚至菌株等精細水平識別測得的序列，並獲取對應的微生物物種信息。

2008年，Helicos Biosciences的第一台單分子DNA測序儀以及PacBio SMRT、Nanopore等被相繼研發，第三代單分子測序技術問世。可對DNA序列實現單分子級別的超長讀長測序，因而非常容易讀取微生物的rRNA基因全長序列。但並不能高效地將DNA聚合酶加到測序陣列中；準確性一次性達標的機會低（81-83%）；DNA聚合酶在陣列中降解；總體上每個鹼基測序成本高，因此其應用尚不及二代測序技術普遍。

高通量測序技術在微生物多樣性研究中的應用

隨著高通量測序技術的不斷升級換代，測序通量、讀長和準確度不斷提升，成本大幅度下降。16S rRNA測序分析微生物群多樣性，包括物種注釋和評估、物種組成分析、β多樣性分析、物種差異分析、進化樹分析等。

在過去十幾年間迅速應用於水體、土壤及腸道等微生物群的研究中。在法醫學領域，以16S rRNA基因測序為代表的法醫微生物研究成果也逐步應用於法醫學實踐中的生物檢材鑒定、個體識別、死亡時間推斷、地域推斷等方面；在醫療領域，基於高通量測序技術分析皮膚、口腔、腸道及呼吸道等菌群結構特徵，為疾病診斷治療帶來了新線索。16S rRNA基因測序技術也在農業、畜牧業，海洋、土壤等環境微生物群落多樣性研究中發揮重要作用。

圖4 微生物多樣性分析流程

展望

近年來高通量測序技術發展迅速，16S rRNA基因測序已廣泛應用於各種生態環境中的微生物多樣性分析。三代測序技術雖然在準確率和測序成本等方面還有待提高，但隨著測序準確度、讀長和通量等參數不斷優化以及測序費用的下降，高質量、高通量的16S rRNA基因全長測序將會成為現實。

此外，16S rRNA相關資料庫的擴大以及生物信息學演算法的不斷開發，也將為微生物群落多樣性研究提供更加準確、全面的信息。16S rRNA基因測序可解讀微生物群落結構，挖掘樣本特性及群落間物種的關聯等，通過與代謝組學、蛋白質組學等多組學聯合，共同揭示微生物與環境或機體間的相互作用機及機理。