wb條帶灰度分析及數據處理：image j灰度值分析教程

傷口癒合實驗（Wound healing assay）是一種操作簡單、經濟實惠的研究細胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法，在SCI論文中得到了廣泛的使用【1】。

如何分析劃痕實驗結果卻令很多人頭疼！劃痕實驗常見的統計指標是統計傷口癒合百分比（Wound healing percentage）和劃痕寬度。傷口癒合百分比本質上是一種面積分析，半夏在往期已經給大家分享過30秒搞定劃痕面積分析，有興趣的童鞋可以自行查看！

劃痕面積的基本分析步驟為：對劃痕圖片進行Process -> Smooth平滑後進行Process -> Find Edges尋找邊緣，再使用Image -> Adjust -> Threshold，閾值選定後進行劃痕面積分析：

劃痕面積的分析相信大家已經很熟悉了，然而使用ImageJ分析實驗劃痕寬度卻困難重重！在網路上我注意到有很多人都對劃痕寬度計算心存疑惑：

關於寬度計算目前常用的方法是使用Plugins -> Analyze -> Grid添加等距的水平線（Horizontal lines）或是垂線，再沿著水平線或是垂直線手動畫出劃痕寬度，再使用Analyze -> Measure進行計算：

這種方法存在缺點：

手動畫線起點和終點欠精確；添加的等距水平線數量有限，得到的平均寬度不準確；工作量大，浪費時間。

01、基礎知識準備

(1)灰度值灰度值純黑為0、純白為255：

（2）Plot Profile

Plot Profile（快捷鍵 Ctrl+K）見於Analyze -> Plot Profile，適用於線和矩形選框，表示線段和矩形選框所經過的範圍內的灰度變化（熒光強度），如下圖：

Plot Profile常用於定性表示熒光共定位【2】與矩形範圍內熒光強度變化【3】：

02、劃痕寬度分析

（1）劃痕面積分析

1. ImageJ打開待分析劃痕圖片，先通過Image -> Type -> 8-bit將圖片格式轉化為8-bit灰度圖片，再通過Process -> Smooth將圖片進行平滑處理，最後點擊Process -> Find Edges尋找邊緣：

2. Process -> Filters -> Gaussian Blur…Sigma設為6，對圖片進行模糊處理：

3. Image -> Adjust -> Threshold，按照自己需要調整適合的閾值，調整合適後點擊Apply：

此時得到的圖片黑色灰度值為0，白色灰度值為255。

4. 使用魔棒工具選擇劃痕，Edit -> Clear清除劃痕內部的細胞，然後使用Edit -> Clear outside去除非劃痕部分的白色空隙。Edit -> Invert將劃痕轉變為灰色，再次對整張圖片進行反轉，得到劃痕為白色、非劃痕部分為黑色：

5. 驗證所得劃痕面積的準確性

利用魔術棒點擊白色區域，點擊Analyze -> Tools -> ROI Manager…-> Add，打開原圖片，點擊ROI Manager中剛剛Add的區域，此區域將會顯示在原圖片中，通過符合程度返回第3步調整閾值，調整目的區域：

（2）劃痕寬度計算1. 將得到上步驟得到黑白劃痕圖片使用Image -> Transform -> Rotate 90 Degrees Right/Left進行旋轉：

2. Edit -> Selection -> Select All全選整個圖片。點擊Analyze -> Plot Profile，再點擊結果左下角的List，點擊新彈出窗口中Edit -> Copy，複製所有數據，粘貼至新建Excel中：

3. 劃痕寬度分析思路

Plot Profile得到的Gray value變化是整張圖片從左往右對應的每個高度的灰度值的平均值。黑色灰度值為0，白色灰度值（代表劃痕）為255，僅有白色範圍可以影響平均灰度值。

示例劃痕圖片長寬為460*500 pixels，則有460條豎直線覆蓋圖片，下圖X為豎直線編號。劃痕寬度乘以255除以500即對應平均灰度值。反之利用利用公式：(Y*500)/255就可以得到整條線上白色的區域的長度（500為一條線的總長度），也就是劃痕寬度：

進一步可以求每張劃痕的平均寬度。值得注意的是，本次計算劃痕寬度沒有進行標尺校正操作，故得到的寬度單位為像素。在Analyze -> Set Scale進行標尺校正後可以得到其實際距離。
最後，檢查一下所求寬度是否和實際相符：

03、總結

利用對二值化圖片進行Plot Profile操作，我們便捷、準確的獲取了劃痕對應的每一個像素的寬度，這提示我們在日常的科研生活中應該勤于思考、做到舉一反三！今天的給大家分享ImageJ高效分析劃痕寬度就到此為止了，希望對大家有所幫助！

在科研界的江湖中，流傳著一大神器—— ImageJ，堪稱數據圖像分析處理的「倚天劍」。