imagej灰度分析使用步驟：imagej灰度分析結果

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ImageJ (
https://imagej.nih.gov/ij/)是美國National Institutes of Health (NIH)開發的基於Java的免費公共圖像處理軟體，在生物及醫學圖像分析中起著非常重要的作用。

ImageJ可在一個窗口中顯示多個空間或時間相關的圖像，這些圖像集稱為圖像棧（Stack），組成Stack的圖像稱為Slice。Stack圖像是SCI論文中常用的圖像類型：

今天半夏給大家分享Stack圖形的概念、基本操作與實際應用。

1 Stack圖像介紹

數字圖像不僅是二維圖片或具有多個通道的二維圖片，Stack圖片具備有三個空間維度：X，Y和Z。

Hyperstacks具有四個以上維度，例如X（長），Y（寬），Z（片），C（通道）和t（時間幀）。

下圖為ImageJ官網示例Stack圖片t1-head.tiff，2維圖像（XY視圖）窗口如左側窗口（256 x256），當前Slice為129張圖片的第58張。t1-head.tiff圖片屬性如右圖所示：

共聚焦圖片Z-Stack層掃可以得到Stack或Hyperstacks圖片，下圖為共聚焦系列圖片，該圖片包含紅、綠兩通道以及Z軸25張切片：

圖片屬性可通過Image -> Properties得到：

2 如何顯示Stack圖片中的所有切片？

Make Montage可以得到一個單一圖片，該圖片包含Stack圖片中的所有圖像，步驟為：

Image -> Stacks -> Make Montage。Make Montage命令窗口可以通過Columns與Rows設置產生圖片的布局（下圖為7列3行），選擇製作Montage切片的範圍（First Slice，Last Slice）等：

下圖是SCI文章中的Montage圖：

反之，Montage圖也可以轉換成Stack圖。方法為：

Image -> Stacks -> Tools -> Montage to Stack。

3

Stack圖像Orthogonal Views（正交視圖）

正交視圖除顯示Stack圖像的XY視圖外，還可顯示XZ、YZ投影圖像。XZ、YZ投影圖像顯示在原始圖像的旁邊：

步驟為Image -> Stacks -> Orthogonal Views。滑鼠點擊位置為三個視圖的交點，交點可在XY、XZ與YZ視圖中顯示，可以拖動滑鼠來控制交點位置：

拓展：正交視圖的應用

正交視圖在SCI論文中常用來顯示三維共定位，下圖層掃共聚焦圖片通過正交視圖可顯示BrdU與GAD在三維空間中存在共定位：

正交視圖實際上僅能提供來自不同角度的臨時數據，如何得到上述SCI論文中顯示的圖片？

以confocal-series.tif圖像為例，步驟如下：

1、 ImageJ軟體打開confocal-series.tif，Image -> Color -> Stack to RGB將多通道圖片轉變為RGB圖片，此時confocal-series.tif為RGB圖片且包含多張切片：

2、 正交視圖：Image -> Stacks -> Orthogonal Views

3、 保存XY、XZ與YZ視圖

XZ、YZ視圖直接通過File -> Save as tiff：

XY視圖保存：

XY視圖保存需要將不同切片進行Z方向投影，方法為Image -> Stacks -> Z projection…

Z projection功能支持6種不同的投影方式：

Average Intensity，均值投影，每個圖像的像素是Stack圖像中所有圖像在相應位置像素的均值。

Max/Min Intensity，最大/最小投影，圖像中每個像素是Stack圖像中相同位置所有圖像中的最大/最小值。

Sum Slices，Stack圖像的總和。

Standard Deviation，所有切片的標準差。

Median，中值投影輸出的圖像，圖像中每個像素是Stack圖像中在相應位置像素的中值。

在此我們選擇Max Intensity，得到XY視圖：

File -> Save as tiff即可。

4、打開PhotoShop（PS），打開保存好的XY、XZ與YZ視圖：

使用直線工具在各視圖中畫直線：

得到SCI文獻中三維共定位正交視圖：

拓展：

Z projection可將共聚焦層掃圖片進行最大密度投影得到清晰的圖像，例如具備突起的細胞。左側為Stack圖片，右側為經過Z projection最大密度投影的圖片，最大密度投影的圖片可以完整的顯示星形膠質細胞的突起：

4 Stack圖像3D投影

3D投影是用來創建一個沿著（X、Y或Z軸）旋轉的投影，該投影具有三維效果。

步驟為：Image -> Stacks -> 3D Projection…

File -> Save as Gif可以創建3D效果的動圖，SCI論文中可以用這種方法來顯示三維動態效果：

5 Stack圖像繪製Z軸剖面圖

Z軸剖面圖可以獲得選擇ROI（感興趣區）的平均灰度值，方法為：

Image -> Stacks -> Plot Z-axis Profile…

使用矩形、橢圓、不規則或自由形狀工具在confocal-series.tif中繪製ROI：

點擊Plot Z-axis Profile 獲得結果Live即可得到實時ROI對應的Z軸剖面圖：

應用實例：

分析時間序列圖像。下圖是Elife（IF=7.616）中記錄時間依賴的鈣成像，橫坐標是時間縱坐標是鈣信號，反映的是不同時間點鈣信號的動態變化：

步驟：

1、 ImageJ打開時間序列Stack圖像，Z軸為時間：

2、 添加感興趣的ROI，Image -> Stacks -> Plot Z-axis Profile…即可得到ROI熒光強度隨時間的變化：

點擊List得到ROI熒光強度隨時間的變化的數值，保存數據可進行重新繪圖：

今天給大家分享了ImageJ分析Stack圖像的基本操作及其實際應用，希望對大家有所幫助！