RNA-Seq技術介紹

一、RNA-Seq分析

RNA-Seq是基於第二代高通量測序技術的一種新的轉錄組測序技術，用於定性和定量研究轉錄組及其表達變化。與傳統低通量測序技術相比，RNA-Seq有較高的覆蓋度和靈敏度，可以檢測到所有轉錄本，並能夠檢測到新的轉錄本。

RNA-Seq可以對mRNA、ncRNA、小RNA等不同類型的RNA進行定量分析，可以幫助人們在轉錄組水平理解基因調控和表達變化等過程。

# RNA-Seq分析代碼示例
## 定量分析
quantification <- quantTrimmed(ids, gtf, fa, inputDir, outputDir, 'paired-end')

## 差異分析
DEgenes <- diffAnalysis(quantification, outputDir, treat, ctl)

二、幾種RNA-Seq建庫方法

RNA-Seq建庫方法包括兩種：一種是基於全長轉錄本的建庫方法（Full-length Transcript Sequencing，FTS）,另一種是基於短序列的建庫方法（short read sequencing），也稱為RNA-Seq。FTS的建庫方法有：SMARTer、TAKARA等，這種建庫方法可以區分多個轉錄本，並且可以輕易的發現獨特的內部外顯子；RNA-Seq的方法則是利用鹼基突變監測RNA上的轉錄本表達。

# 幾種RNA-Seq建庫方法示例代碼
## SMARTer建庫
building <- SMARTer(gene, fa)

## TAKARA建庫
building <- takara(gene, fa)

## 鹼基突變監測RNA上的轉錄本表達
ReadCov <- RNA_seq(Illumina_Reads, Genome, gene_annot)

三、RNA-Seq流程

RNA-Seq流程包括幾個步驟：首先是RNA提取，獲得RNA樣本；然後是RNA破碎，將RNA打碎，得到RNA片段；接著是文庫構建，將RNA片段轉化成能夠測序的文庫；最後是高通量測序，將文庫進行測序，並得到原始測序數據。

從原始測序數據的清洗、比對、計數和差異表達基因分析，再到富集分析等應用，RNA-Seq分析已經成為基因表達調控研究的常用分析方法，如差異基因表達、可變剪接等。

# RNA-Seq流程示例代碼
## RNA提取
RNA_extract <- RNA_Extract(tissuesamples)

## RNA破碎
RNA_fragmentation <- RNA_fragmentation(RNA_extract)

## 文庫構建
library_create <- library_create(RNA_fragmentation)

## 高通量測序
high_throughput_seq <- high_throughput_seq(library_create)

## 比對
alignment<-Hisat2(genome_index,reads,alignment)

## 計數
Counts<-Featurecount(Genome, gtf, alignment, outdir)

## 差異表達基因分析
diffGene<-DESeq2(Counts, treatment, outputDir)

四、RNAse清除劑

RNA分子極為活潑，容易在樣本採集或提取、處理過程中受到污染和降解。RNAse清除劑可以去除或抑制RNAse的活性，防止RNA的降解和樣品的污染。

RNAse清除劑通常需要添加到RNA提取試劑中或直接加入樣本中進行保護。使用RNAse清除劑可以保證RNA的完整性和穩定性，提高RNA-Seq實驗的可靠性和準確性。

# RNAse清除劑示例代碼
## 添加到RNA提取試劑中
RNA_extract_add_RNAseClear <- Add_RNAseClear(RNA_extract)

## 直接加入樣本中進行保護
direct_add_RNAseClear <- Add_RNAseClear(Samples)

五、RNA-Seq樣本要求

RNA-Seq實驗需要高質量的RNA樣本，常用的RNA提取樣本包括組織、細胞、血液等，在實驗前需要準確地了解樣本的來源、處理方法、存儲方式等信息。

為了保證RNA-Seq的成功和可靠性，樣本的DNA和RNA的質量需要在實驗前進行檢測和評估。常見的檢測方法有瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop檢測。

# RNA-Seq樣本要求示例代碼
## 樣本來源
tissue_sample <- Sample_from_tissue(tissue)

## 樣本的處理方法和存儲方式
Sample_Processing_and_Storage <- Processing_and_Storage(sample)

## 樣本質量檢測和評估
Sample_quality_monitoring <- Quality_Monitoring(RNA_Sample)

六、RNA-Seq測序價格

隨著高通量測序技術的不斷發展，RNA-Seq的價格也在不斷下降。RNA-Seq測序價格的主要影響因素包括樣本數量、文庫製備方式、數據量等。一般情況下，RNA-Seq的實驗費用在1萬-6萬之間。

# RNA-Seq測序價格示例代碼
## 根據樣本數量計算費用
total_price <- Sample_num * price_per_sample

## 根據文庫製備方式計算費用
total_price <- Library_build * price_of_library

## 根據數據量計算費用
total_price <- Data_Size * price_of_Data

七、RNA-Seq數據分析

RNA-Seq數據分析包括數據質控、比對、計數、歸一化、差異基因分析等步驟。數據質控是RNA-Seq的重要步驟，可以幫助人們判斷樣本的質量和RNA提取的完整性。比對可以將原始測序數據映射到基因組或轉錄本組上，計數可以得到每個基因的表達量。歸一化可以消除測序深度和樣本之間基因表達量的差異，差異基因分析可以篩選出在不同條件下表達量有顯著差異的基因。

# RNA-Seq數據分析示例代碼
## 數據質控
QC_Data <- FastQC(RawData)

## 比對
Alignment <- HISAT2(RawData, Index)

## 計數
Counting <- FeatureCounts(Alignment, GTF)

## 歸一化
Normalization <- DESeq2(Counting, group)

## 差異基因分析
DEanalysis <- DESeq2(Normalization, batch)

八、RNA的全稱

RNA的英文全稱是Ribonucleic acid，中文名稱是核糖核酸。

九、RNA-Seq和qPCR區別

RNA-Seq和qPCR（quantitative PCR）是兩種基因表達分析方法。qPCR是一種定量分析方法，可以精確測定單個轉錄本的表達量，通過引物擴增來分析靶基因的表達數量。RNA-Seq技術可以分析基因整個轉錄本的表達水平和轉錄複雜性，並可以檢測新的轉錄本，但無法精確定量單個轉錄本的表達量。

# qPCR的代碼示例
## 引物設計
Forward_Primer = 'ATGAGATTACATAAGCAGAAGCTG'                        
Reverse_Primer = 'TTACAAGAGAGCAGCAGTGGTT'                              
qPCR_Probe = 'AACTGATAAACTTAGAGGTCATCCCACAAATCG'     
          
##q-PCR
qPCR=quantitative_PCR(Template, Forward_Primer, Reverse_Primer, qPCR_Probe)

十、RNA前體選取

RNA前體選取技術（RNA-Protein Interaction Profiling）是一種在轉錄組水平研究mRNA、ncRNA和蛋白質間相互作用的方法。RNA前體選取技術可以很好地研究RNA相互作用蛋白質的特徵，如結合位點和結合特異性等。

# RNA前體選取示例代碼
## RNA前體選取文庫構建
Library_Construction <- RNA_Pro_Profiling(RNA_sample)

## RNA前體選取測序
RNA_Profiling_Seq <- RNA_Profiling_Seq(Library_Construction)

## RNA前體選取分析
RNA_Profiling_Analysis <- RNA_Profiling_Analysis(RNA_Profiling_Seq)