cellranger: 一個用於單細胞RNA測序分析的完整分析管道

一、簡介

cellranger是10x Genomics公司開發的一個基於Illumina測序平台的單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析工具，主要用於處理10x Genomics的單細胞bead-based測序數據。它是一個完整的分析管道，可以執行從原始數據到表達矩陣、細胞聚類、細胞分型和單細胞基因表達分析等一系列分析，支持多種分析流程，包括 5’ gene expression、3’ gene expression、VDJ和feature barcode分析。

二、安裝

cellranger官方提供了Linux和MacOS的二進制安裝包，可在任何支持Bash的操作系統上安裝。安裝步驟如下：

1. 下載安裝包：https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest
2. 解壓縮安裝包：tar -xzvf cellranger-VERSION.tar.gz
3. 添加cellranger到PATH環境變量：export PATH=$PATH:/path/to/cellranger-VERSION

三、使用

1. 準備數據

在使用cellranger之前，需要將原始數據（fastq格式）拆分成多個樣本的fastq文件，每個樣本一個文件夾，文件夾名稱為樣本名稱。拆分後的文件夾存儲在一個主目錄下。

Main_directory/
├── Sample1/
│   ├── R1.fastq.gz
│   └── R2.fastq.gz
├── Sample2/
│   ├── R1.fastq.gz
│   └── R2.fastq.gz
└── Sample3/
    ├── R1.fastq.gz
    └── R2.fastq.gz

2. 運行分析管道

在運行分析管道前，需要準備好參考基因組和注釋信息。cellranger支持多個物種的常見基因組和注釋信息。可以從10x Genomics網站中下載相應物種的參考數據，也可以使用自己的自定義參考數據。

cellranger count \
    --id=Sample1_count \
    --transcriptome=/opt/refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0 \
    --fastqs=Main_directory/Sample1 \
    --sample=Sample1

3. 分析結果

cellranger會生成一個報告文件，包括不同質量控制步驟的圖表和統計信息。報告文件位於輸出目錄下的“outs/web_summary.html”。

同時，在輸出目錄還包含多個輸出文件：

• barcodes.tsv.gz: 包含每個細胞的唯一barcode。
• genes.tsv.gz: 包含所有基因的信息。
• matrix.mtx.gz: 包含每個細胞和每個基因的測序計數。
• web_summary.html: cellranger在分析過程中生成的報告文件。

四、擴展

1. Seurat和Scanpy

雖然cellranger可以執行許多重要的分析步驟，但不足以涵蓋整個單細胞RNA-seq數據分析的範圍。為了進一步分析和可視化結果，需要使用其他工具，例如Seurat（R語言包）和Scanpy（Python包）。Seurat可以幫助您執行聚類、圖形可視化和差異表達分析等操作，而Scanpy提供了與Scipy、Numpy和Pandas等Python庫的無縫集成，可以進行類似的分析。

2. 參考數據

當處理不同物種或具有不同基因組的樣本時，需要進行參考數據的自定義。cellranger提供了一個參考數據製作工具，可以幫助您準備自己的參考數據，以便用於分析同種類中的多個樣本。

cellranger mkref \
    --genome=MyGenome \
    --fasta=/path/to/genome.fa \
    --genes=/path/to/genes.gtf

3. 結果後處理

在聚類後，可以使用Seurat對聚類結果進行可視化、交互式探索和差異表達分析。Seurat提供了多種應用和技術，包括降維、聚類、比較、集群顯著性分析和可視化。可以使用以下示例代碼從cellranger輸出創建Seurat對象：

library(Seurat)
counts <- Read10X(data.dir = 'path/to/outs/filtered_feature_bc_matrix')
seurat_obj <- CreateSeuratObject(counts, project = 'MyProject')
seurat_obj