使用FastQC進行質量控制的詳細說明

一、安裝FastQC

FastQC是一個免費的、開源的軟件，可以在官網(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)下載安裝。安裝非常簡單，只需要下載對應版本的二進制文件並解壓，即可使用。FastQC是一個Java程序，因此需要確保安裝了Java運行時環境。

二、使用FastQC進行測序數據質量控制

FastQC可以用於對Illumina、SOLiD、Ion Torrent和PacBio測序數據進行質量控制。

1. 計算測序數據質量分布

FastQC通過計算測序數據的質量分布，幫助我們了解數據的質量和相關的問題，如低質量鹼基、過度的鹼基偏差、過度的N鹼基等，便於我們優化下游分析。

fastqc -o output_dir fastq_files

其中，-o選項表示輸出結果的目錄，fastq_files為待處理的FASTQ格式的測序數據文件。

FastQC支持同時處理多個文件，在命令行中對文件列表進行逗號分隔即可。例如：

fastqc -o output_dir file1.fastq.gz,file2.fastq.gz,file3.fastq.gz

FastQC會自動識別輸入文件的格式，無需手動指定。

2. FastQC結果解釋

FastQC處理後生成的報告分為三塊。第一部分是該樣本的總體質量摘要，包括序列總數、序列長度、質量分布等；第二部分是每個鹼基的質量分布柱狀圖；第三部分是檢測到的各種問題的詳細說明和解釋。

（1）總體質量摘要

總體質量摘要包括多個模塊，其中包括基本統計數據、序列長度分布、質量分布和序列GC含量等。這些模塊會描述文件中所有序列的總體質量，包括序列長度、質量值和其他統計性質。通過檢查這個模塊，可以確定數據的總體質量。

（2）每個鹼基的質量分布柱狀圖

相比於總體摘要，這個模塊主要關注質量分布問題。

這個模塊是FastQC報告中最常引用和最易解釋的部分。FastQC會為每個位置繪製一個圖表，圖表中包括不同的質量分數和其數量。對於每個質量擺動範圍內的分數，圖表中會有一個垂直的條形區域以及該質量分數對應的條形的面積。因此如果大多數鹼基都具有30或更高的質量，那麼在圖表的左側將會有一個非常高的條形，而在比30低的質量分數下，相應的條形可以很小（或不存在），這是質量分布良好的示例。

（3）問題和解釋

這個模塊會識別FastQC發現的數據問題，將它們列出，並提供對每個問題的詳細解釋。FastQC報告包含的圖表、表格和解釋，可以用來解釋檢測到的任何問題。

3. FastQC結果的處理

如果FastQC檢測到任何問題，需要評估這些問題對後續分析的影響。以低質量鹼基為例，如果序列中有大量低質量鹼基，將會影響序列長度和相似性搜索結果的準確性，可能會影響從序列中提取的功能信息。在這種情況下，可以使用低質量過濾器將低質量序列去除，以提高後續分析的準確性。

fastq_quality_filter -q 20 -p 80 -i in_file.fastq -o out_file.fastq

此命令將從in_file.fastq中刪除80％的序列，並將序列寫入out_file.fastq。只有序列中每個鹼基的質量分數大於或等於20的序列保留。

三、小結

FastQC提供了一個快速、簡便的方法來評估測序數據的質量，對於下游數據分析和工作流的設計都非常有用。除了單個數據集之外，它還支持多個數據集的處理，可以輕鬆地與其他Ngs分析工具集成。