高通量測序原理，tm值計算公式

做過分子實驗的人都知道，要想做的有效率有質量是很苦逼的，1個月做100個克隆那都是小case，沒點看家的本事怎麼行。如果再遇到比較極品的稀有基因，周旋個把月，那也是家常便飯。下面就和大家分享一些載體構建的經驗，從此邁向科研達人：

1. 準備工作

俗話說：用欲善其事，必先利其器。建議大家在做構建之前先找好工具，效果事半功倍哦。推薦兩個工具，一個是oligo軟件，常用於引物設計和酶切位點分析；另一個是DNAstar軟件，工具極強大，一款全面的生物醫學軟件，用作DNA和蛋白質序列分析、重疊群拼接和基因工程管理。

插播個笑話：聽說隔壁實驗室里有個學醫的學生來做課題，很聰明很刻苦，但除了他以外，包括老闆在內都是生物物理背景，整個實驗室對分子生物就只有一個粗淺的概念，這個學生就想把一個質粒上的基因插到另一個質粒上去，要是我就先查查有沒有合適的酶切位點，要沒有就改造一下質粒一切搞定，這學生他不懂啊（要命的是她老闆固然牛，對這方面也不懂），自己辛辛苦苦設計了PCR引物去做PCR，P了將近5K的產物去測序，結果測的結果中間有個突變，要懂的就找找酶切位點，從原來的替換上去，然後測這下這段就行。他呢，又送去了若干了質粒一個接一個的測，他光測序就要花好幾千（你得佩服她老闆真有錢呀）。這件事教育我們準備工作是多麼重要。

2. 設計引物

1) 注重要：看懂質粒圖譜！拿大家比較熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。

想用N1質粒，設計引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下來結果根本不表達融合蛋白，你就死了；C1質粒，注意閱讀框，要是移碼了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚別弄竄了。一句話，要看懂你的圖譜！

其他需要注意：

設計酶切位點時要加保護鹼基（大家要用T載體就當我沒說）;
酶切位點設計原則：盡量用粘性末端，實在不行就用一些常用平端酶，如EcoRV和SnaB1等，要是以後還有別的用處就多加點酶切位點，曾一口氣在引物上加了五個酶切位點以防以後要用到，注意計算TM值的時候要減去這些不匹配的序列；
注意KOZAK序列的問題，很多質粒沒有提供KOZAK序列，這要在設計的時候直接在引物上加好。
擅用Gene Overlap，比方說加個flag標籤，his標籤，my標籤之類的，直接設計三引物overlap一下就可以，省得還要再多構建一步，這些都是設計引物時候就要考慮好的。引物長一點不要緊（我最喜歡兩步法了），尤其是對GC比高的序列，有時候引物不長PCR根本不出結果，注意如果GC比較高，這個時候Gene Overlap就不要做了，很麻煩，克隆很難挑。
沒有合適的酶切位點？很簡單，用同尾酶策略，比方說Bgl2和BamH1，Nhe1和spe1，Xho1和Sal1（注意連上了切不下來），實在不行就平端吧。

3. PCR擴增

如果沒有現成的質粒可供酶切，PCR是最理想也是最方便的策略。目前市面上可選擇的PCR酶實在太多，每隔一段時間還會升級，正常情況下，高保真的taq酶都能滿足需求。但如果遇到難PCR的高GC基因，可以換不同PCR酶，添加一些 DMSO，甘油等，實在不行可以考慮Clontech的2 GC rich kit，價格和實力都大牛。另外，建議電泳切膠回收純化PCR產物，去除一些非特異性條帶。

4. 酶切

強烈推薦NEB的內切酶，記得有一次用別家的酶切過夜，結果質粒都被切碎了（當然當時質粒濃度也不高），而用NEB的酶，切個七十二小時仍舊一切OK，尤其現在NEB還推出了HF的內切酶，沒有星活性而且統一都用Buffer4。另外TAKARA的酶也還可以。

5. 連接

最常用的是NEB的T4連接酶，很好用，但是注意Buffer里有ATP，反覆凍融ATP失活很快，拿到buffer後就分裝，10uL/管，一次性使用。

載體總量：一般來說，載體濃度在20-100ng/uL較好，太低的話碰撞幾率低，太高的話又會產生很多非目的克隆，總量從50-100ng就可以，太低失敗幾率很高，太高克隆太多，挑克隆會很麻煩，反應總體積也有講究，體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低，而且對感受態細胞也是個挑戰，通用10-15uL。

載體和插入片段比例：載體和插入片段比例一般是1:7，如果很難連接，比如說平端連接，要適當提高片段濃度，同時加大比例1:10。

6. 轉化

按照SOP做就行，話說實驗室原來從takara買感受態（competent cell），後來發現還是自己做的效率高（protocol免費索取）。要注意的是LB必須無菌而且沒有抗生素，實驗室原來有個技術員，做一次失敗一次，我就奇怪了，後來才發現他用的居然是加了kana的LB，直接暈過去了。

7. 鑒定

想要快速鑒定，建議用菌液PCR，菌液PCR是有一定講究的，很多人做菌液PCR鑒定假陽性特多，為什麼？因為你PCR引物選的都在載體上，注意引物必須分別在載體和插入片段上才准，PCR方法鑒定是極其準確的，數百次菌液PCR經驗。PCR鑒定做起來也很簡單，拿個2mL tube，裝0.5mL 加入相應抗生素的LB，搖個三小時左後取1uL做模板就行了。如果想更快，直接菌落PCR也不錯，效果一樣。