HTSeq-count的使用介紹

一、什麼是HTSeq-count

HTSeq-count是一個Python腳本，用於從SAM/BAM文件中計算每個基因對應的讀數，並將計數輸出到各自的基因區間中，以便進行下游分析，如差異表達分析和基因表達量計算。HTSeq-count利用基因區間的GTF（general transfer format）文件進行基因定位，需要讀取SAM/BAM文件並按位置對reads進行分配和計數。

HTSeq-count對分配到多個基因的reads進行處理，對於這類reads，它將其計數分配到與之關聯的基因的基礎上，而不是等分計算。此外，HTSeq-count還支持stranded數據的讀取和處理，可用於研究物種基因的轉錄本多樣性以及轉錄水平的差異。

二、HTSeq-count的安裝與使用

安裝：HTSeq-count通常與Python 2.x版本使用。使用pip工具安裝HTSeq-count，只需要在命令行中運行以下命令即可：

pip install HTSeq

使用：以下是使用HTSeq-count的一些基本步驟：

1. 準備SAM/BAM文件和GTF文件

htseq-count -f bam -r name -t exon -i gene_id accepted_hits.bam Homo_sapiens.GRCh38.99.gtf > counts.txt

其中，-f指定輸入數據文件的格式，-r指定數據文件的id格式，-t和-i是GTF文件中特徵和屬性的名稱。最後一項是輸入文件和輸出文件的名稱。

2. 運行HTSeq-count腳本：

htseq-count -f bam -s yes -t exon -i gene_id aligments.bam genes.gff > counts.txt

在這個例子中，“-f”指定輸入數據文件的格式為[BAM]，“-t”指定GFF文件中特徵和“–stranded = yes”被設為stranded數據。

將讀取的SAM/BAM文件與GTF/GFF文件相關聯，使用Gene ID計數，輸出計數表格並保存到文件中。

三、HTSeq-count的輸出格式

HTSeq-count輸出的文件包括每行一個基因和其對應的計數。輸出的文件具有以下列：

– Gene ID：GTF文件中的基因ID

– 計數：read計數

默認情況下，HTSeq-count輸出的結果沒有標題行。如果您正在使用HTSeq-count的默認設置，不必添加標題，則結果將包括兩列：

ENSG00000006534	128
ENSG00000006831	433
ENSG00000007062	1333

如果您需要一個標題，可以使用以下命令：

htseq-count -f bam -r name -t exon -i gene_id --stranded=yes --additional-attr=gene_name accepted_hits.bam Homo_sapiens.GRCh38.99.gtf | head -n 20 > counts.txt

此外，HTSeq-count支持添加基因名稱和屬性到結果中，並將它們用“\t”分隔。例如，要添加基因名稱，使用“- -additional-attr=gene_name”選項：

ENSG00000089124	16	HLA-A
ENSG00000134108	0	GHRL
ENSG00000203997	2	RNU12-2P
ENSG00000228527	0	HMGB1P1
ENSG00000236824	16	HLA-DRB5
ENSG00000186827	630	TRIM21
ENSG00000150337	0	CDKN2A-AS1
ENSG00000108455	207	C3

四、HTSeq-count的參數詳解

HTSeq-count還有一些參數可以進一步定製其功能：

– f 格式

輸入文件的格式，可以是SAM或BAM文件格式。

– s

可以是[yes/no/reverse]，指定read是否stranded

– t 特徵類型

用於生成計數的特徵類型，可以是exon/intron/CDS等。 例：-t exon。

– i 屬性名

用作主要ID的屬性。例如，如果GFF條目的第9列為“gene_id”，則可以通過使用-i gene_id選項將讀數計數到這些ID中。

– m mode

（可選）特徵的測量模式。模式可以是union / intersection-strict / intersection-nonempty。默認情況下，模式為”union”，即所有重疊的特徵都計數。

– o 格式

輸出文件格式, 例如BAM / SAM / BED / none / ‘name sorted bed’等格式。

– n 每個read可計入的最大特徵數

默認情況下，每個read只能可計入一次，但此參數用於在讀取和特徵之間建立多對多的關聯關係。默認值為1。

五、HTSeq-count的優化和考慮事項

考慮到HTSeq-count讀取、匹配和處理龐大的數據集以及高效處理各種單元格格式的需求，以下是一些優化和考慮事項：

1. 優化內存管理

使用內存映射技術Memorymapping，可以將文件讀取到內存中，並允許從內存而不是硬盤驅動器中讀取它們。這可以優化讀取速度並降低訪問文件的內存消耗。

2. 選擇正確的算法

HTSeq-count使用的是Python語言，因此，可以選擇一個適合特定任務的Python庫來提高性能。例如， numpy 提供快速的數組運算和操作算法，pysam提供了對SAM / BAM隨機讀取器的更好支持。

3. 了解文件格式

在使用HTSeq-count時，最好了解數據文件的格式，以便為讀取和處理準備好適當的選項。

六、總結

HTSeq-count是一個用於從SAM/BAM文件計算每個基因對應的讀數的Python腳本，它使用GTF文件進行基因定位，並支持stranded數據的讀取和處理。HTSeq-count的輸出格式包括每行一個基因和其對應的計數，並且支持添加基因名稱和屬性到結果中。

優化HTSeq-count的內存管理，選擇適合特定任務的Python庫，了解文件格式等，能夠提高其性能。熟練使用HTSeq-count需要深入了解其參數和使用方法，才能得到準確和高效的結果。