差異表達基因研究

一、背景介紹

差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)指的是在不同樣本之間表達量顯著不同的基因。區分出這些基因對於深入了解物種內部基因表達的變化和表徵特定生物學過程至關重要。在生物醫學研究方面，差異基因的研究可以發現與疾病的關聯性，有助於深入理解疾病的發生機制和治療方式。因此，DEG分析成為了當前生物信息學領域一大熱門研究課題。

二、DEG分析流程

DEG分析的一般流程包括基因差異表達的檢測和分析，結果的生物信息學功能注釋和驗證，以及生信數據的可視化。下圖展示了一個簡單的DEG分析流程：

樣本準備 -> RNA提取 -> RNA質量檢測和準備 -> (RNA-seq 或者 Microarray)轉錄組測序 -> 原始數據清洗和過濾 -> 讀數比對和基因表達矩陣的計算 -> 差異基因分析和生物學分析 -> 可視化結果呈現

三、差異基因工具與算法

常見的DEG分析工具有edgeR、DESeq2、limma、Cuffdiff等。這些工具往往採用負二項分布、泊松分布和線性模型等多種統計學方法，結合False discovery rate(FDR)等多種校正方法，來確定差異基因。

四、關鍵步驟解析

4.1 數據預處理

對於RNA-seq和Microarray數據，必須進行質量控制和過濾，去除無用的數據和噪聲干擾，生成一個高質量的差異表達矩陣。

# Quality control
fastqc raw_data.fastq -o output_folder
fastqc processed_data.fastq -o output_folder

# Trimming and Filtering
trimmomatic -trimlog samples.log PE read1.fastq read2.fastq output_forward_paired.fq output_forward_unpaired.fq output_reverse_paired.fq output_reverse_unpaired.fq < trimming_parameters.txt

# Read Mapping and Counting
hisat2 -x index -1 read1.fq -2 read2.fq --rna-strandness RF -S samfile.sam
samtools view -bS -o bamfile.bam samfile.sam
samtools sort bamfile.bam -o sorted.bam
samtools index sorted.bam

featureCounts -p -T 8 -a gene_annotation.gtf -t exon -g gene_id -o reads_count.txt sorted.bam

4.2 差異基因檢測

根據基因表達矩陣，使用統計學方法來檢測差異表達基因，並根據p值、FDR等指標篩選出顯著差異基因。

# Differential Expression Analysis
library(DESeq2)
library(edgeR)

dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData, design= ~ condition)
dds <- DESeq(dds)

res <- results(dds)

dge <- DGEList(counts=countData, group=group)
dge <- calcNormFactors(dge)
dge <- estimateCommonDisp(dge)
dge <- estimateTagwiseDisp(dge)

fit <- glmQLFit(dge)
qlf <- glmQLFTest(fit, coef=2)
topTags(qlf, n=10)

4.3差異基因生物學功能注釋

對於差異基因進行生物學功能注釋，確定DEGs對於生物學過程、通路和分子功能的影響。

# Gene Ontology Analysis
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)

gene.list <- rownames(res)[which(res$padj  1)]

ego <- enrichGO(gene = gene.list, OrgDb = org.Hs.eg.db, keyType = "ENSEMBL", 
                ont = "BP", pAdjustMethod = "BH", qvalueCutoff =0.05, universe = NULL)
head(summary(ego))

# Functional Annotation Clustering
ego_bp_clusters <- enrichResult(ego)$Description
ego_bp_clusters <- gsub(pattern = "\\(GO\\:[0-9]{7}.*?\\)$", 
                        replacement = "", 
                        x = ego_bp_clusters)
ego_bp_clusters <- gsub(pattern = "^.*?\\.", 
                        replacement = "", 
                        x = ego_bp_clusters)
ego_bp_clusters <- data.frame(Cluster = ego_bp_clusters,
                              Term = enrichResult(ego)$Description,
                              geneCount = enrichResult(ego)$Count)
biplotAnnotations(ego, which = "prcomp", xlab = "PC1(16%)", ylab = "PC2(12.5%)")

4.4 可視化展示

根據差異基因篩選結果，用圖表的方式展示DEGs在不同條件下的表達變化。

# Heatmap Visualization
library(pheatmap)
library(RColorBrewer)

heatmap_data <- as.matrix(countData[c(1:10, 20:30, 40:50), ])
heatmap_data  10, ]
heatmap_metadata <- metadata[c(1:10, 20:30, 40:50), ]
heatmap_colors <- colorRampPalette(brewer.pal(9, "YlOrRd"))(100)

pheatmap(heatmap_data, color = heatmap_colors, 
         border_color = NA,
         fontsize_row = 10,
         fontsize_col = 10,
         main = "Differential Expression Analysis",
         clustering_distance_rows = "euclidean",
         clustering_distance_cols = "euclidean",
         clustering_method = "complete",
         show_rownames = F,
         show_colnames = T,
         annotation_col = heatmap_metadata)

五、總結

差異表達基因作為生物信息學領域的熱點研究，應用廣泛。對於DEG分析，研究人員應根據數據量、數據類型和數據質量等特點，確定適合的方法和流程。以上的DEG分析流程僅為一個示例，實際應用中還需要根據數據類型和生物學特點進行差異基因分析。相信在不斷的探索和實踐中，DEG分析技術將會不斷完善，並為生物醫學、農業科技等領域的研究提供有力支持。