RNA-seq測序

一、RNA-seq測序流程步驟

RNA-seq測序是一種高通量測序技術，用於研究RNA分子的表達和轉錄組學。通常步驟如下：

1、RNA提取：提取樣本中的RNA，可以使用化學方法或者機械方法。

2、RNA處理：將RNA進行凈化，去除DNA、蛋白、RNA降解產物等雜質。

3、RNA測序庫製備：將RNA經過聚合酶逆轉錄為cDNA，然後加入標籤，通過PCR擴增得到文庫。

4、高通量測序：將文庫進行高通量測序，通常使用Illumina測序平台。

5、數據分析：將測序得到的reads對應到參考基因組上，進行定量和差異表達分析。

二、RNA-seq測序結果分析

RNA-seq測序結果分析包括如下方面：

1、質量評估：檢查測序數據的質量和質量值分布。

2、去除連接序列和低質量序列：對測序數據進行過濾和修剪，去除連接序列和低質量序列。

3、比對：使用比對工具將測序reads比對到參考基因組，得到SAM/BAM格式的比對結果。

4、定量：使用基因定量工具通過比對結果統計基因和轉錄本的表達量。

5、差異分析：比較兩組RNA-seq測序的表達數據，分析差異表達基因或轉錄本，對比分析得出某種轉錄本或基因在不同條件下的表達差異情況。

三、RNA測序的目的

RNA測序的主要目的是探究生物體轉錄過程的全景圖，探究轉錄組學的therpeutic target。

常見的RNA-seq測序目的：

1、發現新的基因和轉錄本：RNA-seq技術可以發現不同細胞和組織中的新基因和轉錄本，促進基因組學和轉錄組學的發展。

2、表達量分析：RNA-seq數據可以量化基因和轉錄本的表達，全面展現基因和轉錄本在對應細胞和組織中的表達水平。

3、差異表達分析：RNA-seq數據差異分析可以發現不同基因和轉錄本在不同條件下的表達變化，為理解生物體發育、生理和病理狀態提供線索。

4、功能注釋: RNA-seq的分析可以進行基因和轉錄本的功能注釋，預測在生理、生化和進化等方面的重要性。

四、如何確定RNA-seq的測序深度

RNA-seq測序深度是指測序產出的總reads數目，決定了RNA-seq測序的覆蓋度和檢測的基因數量。

一般情況下，RNA-seq測序深度建議至少20M reads，對於複雜生物系統或者複雜樣品，建議使用更高的深度。

#RNA-seq測序深度計算
#R表示基因組大小或轉錄組大小
#C表示覆蓋度
#D表示可靠的表達值，根據實驗條件而定，一般為FPKM值


深度reads = （R * C * 2）/ D

五、轉錄組測序和RNA-seq的區別

轉錄組測序是一種方法，分析使用以獲得抽樣樣品中特定組織的所有mRNA分子的那部分信息，該方法產生所有mRNA分子的序列，可以揭示胞內基因轉錄活性的總體狀態，包括信使RNA的濃度和功能區域翻譯後的潛在重組功能。

RNA-seq技術是目前分析基因表達的首選方法，與之前的基因表達分析方法相比，RNA-seq技術可以幫助研究者分析不同細胞或組織中的基因表達量差異，也可以用於鑒定基因的差異剪接，SNPs檢測，表達調控研究，外顯子和內含子的鑒別性表達分析等。