ISO-SEQ：全新的轉錄組研究方案

一、ISO-SEQ價格

ISO-SEQ是一種新的轉錄組研究方案，不同於傳統RNA-seq，它可以直接對全長轉錄本進行測序。相較於RNA-seq，ISO-SEQ的價格稍高，但是其能夠提供更為準確的全長轉錄本信息，對於研究轉錄本異構體和剪接變異等具有重要意義。

二、ISO-SEQ lncRNA

近年來，越來越多的研究表明，非編碼RNA在細胞生命活動中發揮着至關重要的作用。在RNA-seq中，lncRNA的檢測和定量常常存在一定的局限性。然而，ISO-SEQ由於可以對全長轉錄本進行準確的測序，對於lncRNA的檢測和鑒定具有明顯優勢。同時，ISO-SEQ對於lncRNA的表達水平定量也比RNA-seq更為可靠。

三、ISO-SEQ全稱

ISO-SEQ的全稱是Isoform Sequencing，其基本原理是將RNA轉錄本進行反轉錄，然後通過PCR擴增，最後進行高通量測序。由於單次測序讀長比較長（一般為7kb到50kb），因此可以覆蓋絕大多數轉錄本。ISO-SEQ全長轉錄本測序技術為研究全長轉錄本提供了新的思路和技術手段。

四、ISO-SEQ啥意思

ISO-SEQ這個詞源於其全稱中的“Isoform Sequencing”，指的是對全長轉錄本進行測序。ISO-SEQ不僅能夠發現新轉錄本，並對已知轉錄本進行更為全面和精確的分析，還可以檢測轉錄本的剪接變異和異構體水平的表達。

五、ISO-SEQ3

ISO-SEQ3是ISO-SEQ的升級版。相較於之前的版本，ISO-SEQ3的讀長更長，可以達到50kb以上。此外，ISO-SEQ3還優化了反轉錄和擴增步驟，使其更為高效和準確。ISO-SEQ3的出現大大拓展了全長轉錄本測序的應用範圍，為轉錄組研究提供了更為專業的工具。

六、ISO-SEQ測序價格

ISO-SEQ目前的測序價格相較於RNA-seq而言還是比較高的，主要原因是其相對更為複雜的實驗操作和更長的數據質控和分析流程。但是隨着技術的不斷提升和應用的逐步普及，其價格正在逐漸下降。相信在不久的將來，ISO-SEQ將會變得更為實惠和廣泛。

七、ISO-SEQ3轉錄本怎麼去冗餘和預測選取

#!/usr/bin/perl
use Getopt::Long;
use strict;
use FindBin qw($Bin);
use File::Basename qw(basename dirname);
use lib "$Bin/../lib";
use IsoSeq3::PBTools::MergeIsoforms qw(choose_representative_prefix run);
my $CMDLINE = "merge_clustered_isoforms.pl ";
my $VERSION = '20200708';
my $HEADER = "## $CMDLINE v$VERSION\n";
my $usage = <<USAGE;
$HEADER
Usage: perl $0 [options]
 
 
where options are:
 --max_fuzzy_junction [value] : for a multi-segmental isoform, choose stops that have less than [value] fractional unique support
 --max_fuzzy_junction_nreads [value] : for a multi-segmental isoform, choose stops that have less than [value] read counts
 --support_level [value]          : for a multi-segmental isoform, choose from enum: [j|p|mi|lo|i|su], default is "j"    
                                  : excerpt from IsoSeq3 primer:
                                        - j: "junction-only"
                                        - p: "partial"
                                        - mi: "micro-interval
                                        - lo: "long"
                                        - i: "inconsistent"
                                        - su: "SUSPECTED CIRCULARITY"
 --min_alt_fraction [value]     : the minimum alternative fraction to consider when choosing an isoform to represent a cluster. Default is 0.15
 --min_len   [value]            : minimum sequence length after trimming     
 --ice_quiver_mode    [bool]    : whether to run ICE-quiver after clustering. Note that --use_ccs mode is mandatory when this option is enabled.
 --use_ccs    [bool]            : whether to use CCS reads only instead of subreads. Default is false.
 --isoseq_seed [value]          : path to an unpolished cluster.txt file that was generated by a previous pipeline run.
 --tmp_dir_prefix [str]         : the prefix of temporary directory. Default is "isoseq_cluster_tmp".
 --verbose [value]             : print details
USAGE
    ;
my $max_fuzzy_junction = undef;
my $max_fuzzy_junction_nreads = undef;
my $tmp_dir_prefix = "isoseq_cluster_tmp";
my $min_alt_fraction = 0.15;
my $support_level = "j";
my $use_ccs = 0;
my $ice_quiver_mode = 0;
my $help = 0;
my $verbose = 0;
GetOptions(
    "max_fuzzy_junction=i"      => \$max_fuzzy_junction,
    "max_fuzzy_junction_nreads=i"   => \$max_fuzzy_junction_nreads,
    "min_alt_fraction=f"        => \$min_alt_fraction,
    "support_level=s"           => \$support_level,
    "use_ccs=i"                 => \$use_ccs,
    "ice_quiver_mode=i"         => \$ice_quiver_mode,
    "isoseq_seed=s"             => \( my $isoseq_seed ),
    "tmp_dir_prefix=s"          => \$tmp_dir_prefix,
    "verbose"                   => \$verbose,
    "help"                      => \$help,
);
die $usage if $help;
die $usage if ( @ARGV != 2 );
my ( $bamfile, $output_prefix ) = @ARGV;
die "[ERROR] please provide a valid bam file\n" unless ( -s $bamfile );
die "[ERROR] please provide a prefix for the output files\n"
  unless ( defined $output_prefix and length($output_prefix) > 0 );

my $settings = {
    max_fuzzy_junction     => $max_fuzzy_junction,
    max_fuzzy_junction_nreads  => $max_fuzzy_junction_nreads,
    support_level   => $support_level,
    min_alt_fraction    => $min_alt_fraction,
    isoseq_seed => $isoseq_seed,
    verbose     => $verbose,
    use_ccs => $use_ccs,
    ice_quiver_mode => $ice_quiver_mode,
    tmp_dir_prefix => $tmp_dir_prefix,
};
run( $bamfile, $settings, $output_prefix );
choose_representative_prefix( $output_prefix, $bamfile, $settings );

以上代碼是一個perl腳本，用於從clustered isoforms.bam文件中去冗餘和預測選取代表性的轉錄本。使用該腳本需要注意一些參數的設置，如min_alt_fraction表示最小的alternative fraction，設置合適的值可以獲得更為準確的轉錄本信息；support_level表示轉錄本的支持級別，用於篩選較可靠的轉錄本。通過調整這些參數，可以獲得更為優質的ISO-SEQ數據。