RNA-Seq技术介绍

一、RNA-Seq分析

RNA-Seq是基于第二代高通量测序技术的一种新的转录组测序技术，用于定性和定量研究转录组及其表达变化。与传统低通量测序技术相比，RNA-Seq有较高的覆盖度和灵敏度，可以检测到所有转录本，并能够检测到新的转录本。

RNA-Seq可以对mRNA、ncRNA、小RNA等不同类型的RNA进行定量分析，可以帮助人们在转录组水平理解基因调控和表达变化等过程。

# RNA-Seq分析代码示例
## 定量分析
quantification <- quantTrimmed(ids, gtf, fa, inputDir, outputDir, 'paired-end')

## 差异分析
DEgenes <- diffAnalysis(quantification, outputDir, treat, ctl)

二、几种RNA-Seq建库方法

RNA-Seq建库方法包括两种：一种是基于全长转录本的建库方法（Full-length Transcript Sequencing，FTS）,另一种是基于短序列的建库方法（short read sequencing），也称为RNA-Seq。FTS的建库方法有：SMARTer、TAKARA等，这种建库方法可以区分多个转录本，并且可以轻易的发现独特的内部外显子；RNA-Seq的方法则是利用碱基突变监测RNA上的转录本表达。

# 几种RNA-Seq建库方法示例代码
## SMARTer建库
building <- SMARTer(gene, fa)

## TAKARA建库
building <- takara(gene, fa)

## 碱基突变监测RNA上的转录本表达
ReadCov <- RNA_seq(Illumina_Reads, Genome, gene_annot)

三、RNA-Seq流程

RNA-Seq流程包括几个步骤：首先是RNA提取，获得RNA样本；然后是RNA破碎，将RNA打碎，得到RNA片段；接着是文库构建，将RNA片段转化成能够测序的文库；最后是高通量测序，将文库进行测序，并得到原始测序数据。

从原始测序数据的清洗、比对、计数和差异表达基因分析，再到富集分析等应用，RNA-Seq分析已经成为基因表达调控研究的常用分析方法，如差异基因表达、可变剪接等。

# RNA-Seq流程示例代码
## RNA提取
RNA_extract <- RNA_Extract(tissuesamples)

## RNA破碎
RNA_fragmentation <- RNA_fragmentation(RNA_extract)

## 文库构建
library_create <- library_create(RNA_fragmentation)

## 高通量测序
high_throughput_seq <- high_throughput_seq(library_create)

## 比对
alignment<-Hisat2(genome_index,reads,alignment)

## 计数
Counts<-Featurecount(Genome, gtf, alignment, outdir)

## 差异表达基因分析
diffGene<-DESeq2(Counts, treatment, outputDir)

四、RNAse清除剂

RNA分子极为活泼，容易在样本采集或提取、处理过程中受到污染和降解。RNAse清除剂可以去除或抑制RNAse的活性，防止RNA的降解和样品的污染。

RNAse清除剂通常需要添加到RNA提取试剂中或直接加入样本中进行保护。使用RNAse清除剂可以保证RNA的完整性和稳定性，提高RNA-Seq实验的可靠性和准确性。

# RNAse清除剂示例代码
## 添加到RNA提取试剂中
RNA_extract_add_RNAseClear <- Add_RNAseClear(RNA_extract)

## 直接加入样本中进行保护
direct_add_RNAseClear <- Add_RNAseClear(Samples)

五、RNA-Seq样本要求

RNA-Seq实验需要高质量的RNA样本，常用的RNA提取样本包括组织、细胞、血液等，在实验前需要准确地了解样本的来源、处理方法、存储方式等信息。

为了保证RNA-Seq的成功和可靠性，样本的DNA和RNA的质量需要在实验前进行检测和评估。常见的检测方法有琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop检测。

# RNA-Seq样本要求示例代码
## 样本来源
tissue_sample <- Sample_from_tissue(tissue)

## 样本的处理方法和存储方式
Sample_Processing_and_Storage <- Processing_and_Storage(sample)

## 样本质量检测和评估
Sample_quality_monitoring <- Quality_Monitoring(RNA_Sample)

六、RNA-Seq测序价格

随着高通量测序技术的不断发展，RNA-Seq的价格也在不断下降。RNA-Seq测序价格的主要影响因素包括样本数量、文库制备方式、数据量等。一般情况下，RNA-Seq的实验费用在1万-6万之间。

# RNA-Seq测序价格示例代码
## 根据样本数量计算费用
total_price <- Sample_num * price_per_sample

## 根据文库制备方式计算费用
total_price <- Library_build * price_of_library

## 根据数据量计算费用
total_price <- Data_Size * price_of_Data

七、RNA-Seq数据分析

RNA-Seq数据分析包括数据质控、比对、计数、归一化、差异基因分析等步骤。数据质控是RNA-Seq的重要步骤，可以帮助人们判断样本的质量和RNA提取的完整性。比对可以将原始测序数据映射到基因组或转录本组上，计数可以得到每个基因的表达量。归一化可以消除测序深度和样本之间基因表达量的差异，差异基因分析可以筛选出在不同条件下表达量有显著差异的基因。

# RNA-Seq数据分析示例代码
## 数据质控
QC_Data <- FastQC(RawData)

## 比对
Alignment <- HISAT2(RawData, Index)

## 计数
Counting <- FeatureCounts(Alignment, GTF)

## 归一化
Normalization <- DESeq2(Counting, group)

## 差异基因分析
DEanalysis <- DESeq2(Normalization, batch)

八、RNA的全称

RNA的英文全称是Ribonucleic acid，中文名称是核糖核酸。

九、RNA-Seq和qPCR区别

RNA-Seq和qPCR（quantitative PCR）是两种基因表达分析方法。qPCR是一种定量分析方法，可以精确测定单个转录本的表达量，通过引物扩增来分析靶基因的表达数量。RNA-Seq技术可以分析基因整个转录本的表达水平和转录复杂性，并可以检测新的转录本，但无法精确定量单个转录本的表达量。

# qPCR的代码示例
## 引物设计
Forward_Primer = 'ATGAGATTACATAAGCAGAAGCTG'                        
Reverse_Primer = 'TTACAAGAGAGCAGCAGTGGTT'                              
qPCR_Probe = 'AACTGATAAACTTAGAGGTCATCCCACAAATCG'     
          
##q-PCR
qPCR=quantitative_PCR(Template, Forward_Primer, Reverse_Primer, qPCR_Probe)

十、RNA前体选取

RNA前体选取技术（RNA-Protein Interaction Profiling）是一种在转录组水平研究mRNA、ncRNA和蛋白质间相互作用的方法。RNA前体选取技术可以很好地研究RNA相互作用蛋白质的特征，如结合位点和结合特异性等。

# RNA前体选取示例代码
## RNA前体选取文库构建
Library_Construction <- RNA_Pro_Profiling(RNA_sample)

## RNA前体选取测序
RNA_Profiling_Seq <- RNA_Profiling_Seq(Library_Construction)

## RNA前体选取分析
RNA_Profiling_Analysis <- RNA_Profiling_Analysis(RNA_Profiling_Seq)