ISO-SEQ：全新的转录组研究方案

一、ISO-SEQ价格

ISO-SEQ是一种新的转录组研究方案，不同于传统RNA-seq，它可以直接对全长转录本进行测序。相较于RNA-seq，ISO-SEQ的价格稍高，但是其能够提供更为准确的全长转录本信息，对于研究转录本异构体和剪接变异等具有重要意义。

二、ISO-SEQ lncRNA

近年来，越来越多的研究表明，非编码RNA在细胞生命活动中发挥着至关重要的作用。在RNA-seq中，lncRNA的检测和定量常常存在一定的局限性。然而，ISO-SEQ由于可以对全长转录本进行准确的测序，对于lncRNA的检测和鉴定具有明显优势。同时，ISO-SEQ对于lncRNA的表达水平定量也比RNA-seq更为可靠。

三、ISO-SEQ全称

ISO-SEQ的全称是Isoform Sequencing，其基本原理是将RNA转录本进行反转录，然后通过PCR扩增，最后进行高通量测序。由于单次测序读长比较长（一般为7kb到50kb），因此可以覆盖绝大多数转录本。ISO-SEQ全长转录本测序技术为研究全长转录本提供了新的思路和技术手段。

四、ISO-SEQ啥意思

ISO-SEQ这个词源于其全称中的“Isoform Sequencing”，指的是对全长转录本进行测序。ISO-SEQ不仅能够发现新转录本，并对已知转录本进行更为全面和精确的分析，还可以检测转录本的剪接变异和异构体水平的表达。

五、ISO-SEQ3

ISO-SEQ3是ISO-SEQ的升级版。相较于之前的版本，ISO-SEQ3的读长更长，可以达到50kb以上。此外，ISO-SEQ3还优化了反转录和扩增步骤，使其更为高效和准确。ISO-SEQ3的出现大大拓展了全长转录本测序的应用范围，为转录组研究提供了更为专业的工具。

六、ISO-SEQ测序价格

ISO-SEQ目前的测序价格相较于RNA-seq而言还是比较高的，主要原因是其相对更为复杂的实验操作和更长的数据质控和分析流程。但是随着技术的不断提升和应用的逐步普及，其价格正在逐渐下降。相信在不久的将来，ISO-SEQ将会变得更为实惠和广泛。

七、ISO-SEQ3转录本怎么去冗余和预测选取

#!/usr/bin/perl
use Getopt::Long;
use strict;
use FindBin qw($Bin);
use File::Basename qw(basename dirname);
use lib "$Bin/../lib";
use IsoSeq3::PBTools::MergeIsoforms qw(choose_representative_prefix run);
my $CMDLINE = "merge_clustered_isoforms.pl ";
my $VERSION = '20200708';
my $HEADER = "## $CMDLINE v$VERSION\n";
my $usage = <<USAGE;
$HEADER
Usage: perl $0 [options]
 
 
where options are:
 --max_fuzzy_junction [value] : for a multi-segmental isoform, choose stops that have less than [value] fractional unique support
 --max_fuzzy_junction_nreads [value] : for a multi-segmental isoform, choose stops that have less than [value] read counts
 --support_level [value]          : for a multi-segmental isoform, choose from enum: [j|p|mi|lo|i|su], default is "j"    
                                  : excerpt from IsoSeq3 primer:
                                        - j: "junction-only"
                                        - p: "partial"
                                        - mi: "micro-interval
                                        - lo: "long"
                                        - i: "inconsistent"
                                        - su: "SUSPECTED CIRCULARITY"
 --min_alt_fraction [value]     : the minimum alternative fraction to consider when choosing an isoform to represent a cluster. Default is 0.15
 --min_len   [value]            : minimum sequence length after trimming     
 --ice_quiver_mode    [bool]    : whether to run ICE-quiver after clustering. Note that --use_ccs mode is mandatory when this option is enabled.
 --use_ccs    [bool]            : whether to use CCS reads only instead of subreads. Default is false.
 --isoseq_seed [value]          : path to an unpolished cluster.txt file that was generated by a previous pipeline run.
 --tmp_dir_prefix [str]         : the prefix of temporary directory. Default is "isoseq_cluster_tmp".
 --verbose [value]             : print details
USAGE
    ;
my $max_fuzzy_junction = undef;
my $max_fuzzy_junction_nreads = undef;
my $tmp_dir_prefix = "isoseq_cluster_tmp";
my $min_alt_fraction = 0.15;
my $support_level = "j";
my $use_ccs = 0;
my $ice_quiver_mode = 0;
my $help = 0;
my $verbose = 0;
GetOptions(
    "max_fuzzy_junction=i"      => \$max_fuzzy_junction,
    "max_fuzzy_junction_nreads=i"   => \$max_fuzzy_junction_nreads,
    "min_alt_fraction=f"        => \$min_alt_fraction,
    "support_level=s"           => \$support_level,
    "use_ccs=i"                 => \$use_ccs,
    "ice_quiver_mode=i"         => \$ice_quiver_mode,
    "isoseq_seed=s"             => \( my $isoseq_seed ),
    "tmp_dir_prefix=s"          => \$tmp_dir_prefix,
    "verbose"                   => \$verbose,
    "help"                      => \$help,
);
die $usage if $help;
die $usage if ( @ARGV != 2 );
my ( $bamfile, $output_prefix ) = @ARGV;
die "[ERROR] please provide a valid bam file\n" unless ( -s $bamfile );
die "[ERROR] please provide a prefix for the output files\n"
  unless ( defined $output_prefix and length($output_prefix) > 0 );

my $settings = {
    max_fuzzy_junction     => $max_fuzzy_junction,
    max_fuzzy_junction_nreads  => $max_fuzzy_junction_nreads,
    support_level   => $support_level,
    min_alt_fraction    => $min_alt_fraction,
    isoseq_seed => $isoseq_seed,
    verbose     => $verbose,
    use_ccs => $use_ccs,
    ice_quiver_mode => $ice_quiver_mode,
    tmp_dir_prefix => $tmp_dir_prefix,
};
run( $bamfile, $settings, $output_prefix );
choose_representative_prefix( $output_prefix, $bamfile, $settings );

以上代码是一个perl脚本，用于从clustered isoforms.bam文件中去冗余和预测选取代表性的转录本。使用该脚本需要注意一些参数的设置，如min_alt_fraction表示最小的alternative fraction，设置合适的值可以获得更为准确的转录本信息；support_level表示转录本的支持级别，用于筛选较可靠的转录本。通过调整这些参数，可以获得更为优质的ISO-SEQ数据。